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    從鼠尾或其他小樣本中制備基因組DNA

    發(fā)布時間: 2021-12-20  點擊次數(shù): 1439次

    原理

    這一簡單的實驗方案在成百上千的實驗室被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因或基因剔除小鼠的基因型鑒定以及從小量培養(yǎng)的細(xì)胞或組織塊中提取 DNA。

    材料與儀器

    蛋白酶 K 培養(yǎng)的細(xì)胞 鼠尾或小鼠組織
    乙醇 異丙醇 酚 氯仿 異戊醇 磷酸鹽緩沖溶液 SNET TE
    Sorvall 離心機及 H1000B、SH-3000 轉(zhuǎn)頭 聚丙烯管 振蕩平臺 振蕩平臺或振動孵箱 Shepherd 氏鉤

    步驟

    一、材料

    1. 緩沖液及溶液

    乙醇

    異丙醇

    酚:氯仿:異戊醇(25:24:1 V/V)

    磷酸鹽緩沖溶液

    SNET(20 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0),5 mmol/L EDTA ( pH 8.0),400 mmol/L NaCl,1% (m/V) SDS)

    TE ( pH 8.0)

    2. 酶及緩沖液

    蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

    Sorvall 離心機及 H1000B、SH-3000 轉(zhuǎn)頭(或其他相當(dāng)?shù)脑O(shè)備)

    3. 專用設(shè)備

    聚丙烯管(17 X 100 mm)

    室溫及 4℃ 振蕩平臺

    預(yù)設(shè)為 55℃ 的振蕩平臺或振動孵箱

    Shepherd 氏鉤

    4. 細(xì)胞和組織

    培養(yǎng)的細(xì)胞

    鼠尾或小鼠組織

    二、方法

    1. 準(zhǔn)備適量的裂解緩沖液,即在 SNET 中加入蛋白酶 K 使終濃度為 400 μg/ml 向鼠尾或其他組織中加入裂解緩沖液。

    2. 管子垂直放置于振蕩平臺或振動恒溫箱中 55℃ 放置過夜。

    消化過程中樣品的充分混合是非常重要的。過夜消化后,應(yīng)當(dāng)看不到組織或鼠尾,緩沖液呈灰色乳狀液。

    3. 加入等體積的酚: 氯仿: 異戊醇,密閉管口,室溫下置于振蕩平臺 30 min。

    4. 離心分離有機相和水相。17X100 mm 的 Falcon 聚丙烯管中的樣品室溫下 666 g 離心 5 min, 即帶有旋轉(zhuǎn)桶的 Sorvall H1000B 轉(zhuǎn)頭 1800 r/min 或 Sorvall SH3000 旋轉(zhuǎn)桶 1600 r/min。對于較小體積的樣品,樣品置于微量離心管中室溫下用最大轉(zhuǎn)速離心 5 min。轉(zhuǎn)移上層水相至一新的 Falcon 管或微量離心管中。

    5. 加入等體積的異丙醇沉淀 DNA。4℃,13250 g 離心(8000 r/min,Sorvall 3000 轉(zhuǎn)頭或微量離心管中用最大轉(zhuǎn)速)15 min 收集沉淀的 DNA。

    6. 小心除去異丙醇。將 DNA 沉淀浸于 1 ml 70% 的乙醇里。如果沉淀較松散,再離心 5 min。除去 70% 的乙醇,室溫下空氣中干燥沉淀約 15~20 min。

    不要讓 DNA 沉淀*干操,否則極難溶解。

    7. 加入 0.5 ml TE, 4℃ 下輕柔振蕩過夜使核酸沉淀溶解。

    8. 將溶液轉(zhuǎn)移到微量離心管中,室溫保存。

    以上就是本期的內(nèi)容,更多資訊,歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。


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